实验技术服务

TECHNICAL SERVICE

Tunel细胞凋亡检测实验步骤


1.         依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗。

2.         切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止液体流走),在圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织,37℃孵育15min。将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。

3.         切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织,常温下孵育10min,将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。

4.         按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按1:9混合,加到圈内覆盖组织,切片平放于湿盒内,37℃水浴锅孵育60min,湿盒内加少量水保持湿度。

5.         将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片放入用甲醇配制的3%过氧化氢溶液,室温避光孵育20 min,将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。

6.         切片稍甩干后,每张切片加适量试剂3(converter-POD)覆盖组织,切片平放于湿盒内,37℃孵育30min。将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。

7.         切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液,显微镜下控制显色时间,细胞核显色棕黄色为阳性,显色适度后PBS(PH7.4)冲洗切片终止显色。

8.         显色完全后,蒸馏水或自来水冲洗,苏木素复染,1%盐酸酒精分化(约1s),自来水冲洗,氨水返蓝,流水冲洗

9.         将切片依次放入70%酒精5min-80%酒精5min -90%酒精5min -95%酒精5min -无水乙醇Ⅰ5min -无水乙醇Ⅱ5min -二甲苯Ⅰ5min -二甲苯Ⅱ5min中脱水透明,将切片从二甲苯拿出来稍晾干,中性树胶封片。