实验技术服务

TECHNICAL SERVICE

miRNA茎环法(动物细胞、组织与血液 )实验步骤

1、RNA提取

对于贴壁细胞样本

(1)用移液器小心吸去培养基,加入1mL 4℃预冷的PBS溶液,小心摇晃洗去残余培养基,用移液器吸尽PBS溶液,加入1mL Trizol溶液,反复吹打培养瓶/培养基底部及四周,将细胞充分吹打到Trizol中。加入250μL三氯甲烷,充分混匀,冰上静置5min。

(2)混合液4℃,10000g,10min离心。超净工作台中小心吸取上清500μL于1.5mL EP管中,加入等体积4℃预冷的异丙醇,颠倒混匀,-20℃静置15min。

(3)溶液4℃,10000g,10min离心,小心倒掉液体,加入1mL 4℃预冷的75%乙醇,颠倒数次,清洗RNA沉淀,4℃,10000g,5min离心,倒掉液体,于超净工作台中干燥数分钟,将乙醇充分挥发干净,加入10μL RNase-Free Water,充分溶解RNA。

对于悬浮细胞样本

(1)低速离心收集细胞,加入适当体积的冷却的PBS缓冲液重悬,300g离心10 min,吸除上清。重复以上操作两次,收集细胞沉淀。加入1mL Trizol溶液,反复吹打将细胞充分吹打到Trizol中加入250μL三氯甲烷,充分混匀,冰上静置5min。

(2)混合液4℃,10000g,10min离心。超净工作台中小心吸取上清500μL于1.5mL EP管中,加入等体积4℃预冷的异丙醇,颠倒混匀,-20℃静置15min。

(3)溶液4℃,10000g,10min离心,小心倒掉液体,加入1mL 4℃预冷的75%乙醇,颠倒数次,清洗RNA沉淀,4℃,10000g,5min离心,倒掉液体,于超净工作台中干燥数分钟,将乙醇充分挥发干净,加入10μL RNase-Free Water,充分溶解RNA。

对于组织样本

(1)标本于-80℃或液氮中保存,用已经消毒的工具于冰上取约100mg组织,于1mL预冷的Trizol中充分研磨,匀浆液小心倒入1.5mL EP管中,加入250μL三氯甲烷,充分混匀,冰上静置5min。

(2)混合液4℃,10000g,10min离心。超净工作台中小心吸取上清500μL于1.5mL EP管中,加入等体积4℃预冷的异丙醇,颠倒混匀,-20℃静置15min。

(3)溶液4℃,10000g,10min离心,小心倒掉液体,加入1mL 4℃预冷的75%乙醇,颠倒数次,清洗RNA沉淀,4℃,10000g,5min离心,倒掉液体,于超净工作台中干燥数分钟,将乙醇充分挥发干净,加入10μL RNase-Free Water,充分溶解RNA。

对于血液样本

(1)取500μL全血于15mL离心管中,加入10倍体积红细胞裂解液,混匀,室温避光静置10min。

(2)室温,300g,离心10min,弃上清,重复步骤(1),室温,300g,离心10min,弃上清。

(3)PBS重悬细胞沉淀,室温,300g,离心10min,弃上清,100μL PBS重悬细胞,加入1mL Trizol,混匀,静置5min,加入250μL三氯甲烷,充分混匀,冰上静置5min。

(4)混合液4℃,10000g,10min离心。超净工作台中小心吸取上清500μL于1.5mL EP管中,加入等体积4℃预冷的异丙醇,颠倒混匀,-20℃静置15min。

(5)溶液4℃,10000g,10min离心,小心倒掉液体,加入1mL 4℃预冷的75%乙醇,颠倒数次,清洗RNA沉淀,4℃,10000g,5min离心,倒掉液体,于超净工作台中干燥数分钟,将乙醇充分挥发干净,加入10μL RNase-Free Water,充分溶解RNA。

2、第一链cDNA合成

第一链cDNA的合成采用M-MLV逆转录酶试剂盒进行(Invitrogen