实验技术服务

TECHNICAL SERVICE

WB检测实验步骤

1、蛋白提取

1)        贴壁细胞总蛋白提取:

用TBS缓冲液润洗贴壁细胞2-3次,最后一次尽量吸干残留液。加入适当体积的细胞总蛋白提取试剂(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)于培养板/瓶内裂解3-5min。期间反复晃动培养板/瓶,使试剂与细胞充分接触。用细胞刮刀将细胞及试剂刮下,收集到1.5mL离心管中。冰浴30min,期间用移液器反复吹打,确保细胞完全裂解。4℃13000g离心5min,收集上清,即为总蛋白溶液。

2)        悬浮细胞总蛋白提取:

低速离心收集细胞,加入适当体积的冷却的PBS缓冲液重悬,2000rpm离心10 min,吸除上清。重复以上操作两次,收集细胞沉淀。加入适当体积的细胞总蛋白提取试剂(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂),振荡。冰浴30min,期间用移液器反复吹打,确保细胞完全裂解。4℃13000g离心5min,收集上清,即为总蛋白溶液。

3)        组织总蛋白提取:

组织块用预冷的PBS缓冲液漂洗2-3次,去除血污,剪成小块置于匀浆器中。加入10倍于组织体积的组织蛋白提取试剂(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂),冰浴彻底匀浆。将匀浆液转移至离心管中,振荡。冰浴30min,期间用移液器反复吹打,确保匀浆液完全裂解。4℃13000g离心5min,收集上清,即为总蛋白溶液。

4)        胞浆胞核蛋白提取:

收集细胞,将细胞重悬于适当体积的浆蛋白提取试剂(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)中,振荡混匀15秒,使细胞完全悬浮并分散开。如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开,可以适当延长振荡混匀时间。冰浴30 min。高速振荡混匀5秒,4℃13000g离心10 min。吸取上清至一预冷的离心管中,即为细胞浆蛋白。吸尽上清(上清尽量去净,避免浆蛋白污染),加入适当体积的核蛋白提取试剂(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂),高速振荡混匀15秒,使沉淀完全悬浮并分散开。冰浴30min,每隔5min剧烈振荡混匀10~20s,4℃13000g离心10 min。吸取上清至一预冷的离心管中,即为细胞核蛋白。

2、 蛋白浓度定量

使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度。

3、 SDS-PAGE电泳

1)样品处理

①根据样品浓度确定上样量,保证每个样品总蛋白上样量均为40μg。

②在蛋白样品中加入适当量的5×蛋白上样缓冲液,95-100℃沸水浴5min。

2)制胶与上样

①配制分离胶(见附录1),加入TEMED后立即摇匀灌胶。在胶面上缓慢加入适量水以压平胶面,约45min后倒去胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干。

②配制浓缩胶(见附录2),加入TEMED后立即摇匀灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。

③拔出梳子,将电泳架放入电泳槽中,加入电泳缓冲液,将样品加入点样孔中。

④按浓缩胶80V、分离胶120V进行恒压电泳,至溴酚蓝到达胶板下沿。

4、 转膜

1)准备转膜滤纸和PVDF膜,PVDF膜在使用之前先用甲醇活化。

2)按照正负极的方向摆放转膜“三明治”结构,从正极到负极依次为转膜海绵、3层滤纸、PVDF膜、胶、3层滤纸、转膜海绵,摆放过程中要除尽各层中气泡。

3)按300mA恒流转膜,转膜时间根据目的蛋白分子量大小调整。

5、 抗体孵育

1)将转好的膜加入封闭液室温封闭1h。

2)除去封闭液,加入已稀释好的一抗4℃过夜。

3)回收已稀释的一抗,用TBST洗三次,每次5min

4)加入稀释好的二抗,室温孵育30min,用TBST在室温下摇床上洗四次,每次5min。

6、 化学发光检测

1)滴加新鲜配制的ECL混合溶液到膜的蛋白面侧,暗室中曝光。

2)根据不同的光强度调整曝光条件,显影、定影。

7、 结果分析

将胶片进行扫描存档,AlphaEaseFC软件处理系统分析目标带的光密度值。