实验技术服务

TECHNICAL SERVICE

石蜡包埋,石蜡切片实验步骤

1.清理切片:石蜡切片置于65℃烘箱中烘片2h,将切片上的石蜡融化,取出切片,在切片上做好标记将所要做的指标GLUT4写在切片上,将做好标记的切片放在玻片架上。

2.脱蜡至水:依次将装有切片的玻片架放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗。

3.PBS洗:将切片从玻片架上转移到修复盒内,并用PBS洗三次,每次5 min。

4.修复:将新鲜配置的EDTA修复液倒入修复盒内,用透明胶带将修复盒封好,将封好的修复盒放入微波炉中修复,调至中火至沸后断电,间隔10min后调至低火至沸。

5.冷却:将修复好的修复盒拿出来,打开盖子,自然冷却至室温,然后用PBS洗3次,每次5 min。

6.H2O2封闭:将配置好的浓度为3%H2O2溶液倒入修复盒中,盖好盖子,室温下避光孵育10min。

7.画圈:将封闭好的切片用PBS洗3次,每次5 min,然后用组化笔将在玻片上画圈,将组织圈起来。防止加在组织上的试剂流失。

8.BSA封闭:将画好圈的切片甩干后放在湿盒内,在组织上滴加5% BSA封闭20min,每个组织上滴加约100ul。

9.加一抗:甩去切片上的BSA液,不经PSB洗,每张切片加入约50μl用5%BSAl稀释的一抗(GLUT4稀释比:1:100)覆盖组织,放入4℃冰箱过夜。

10.复温:第二天早上取出湿盒,打开湿盒让切片在室温下复温30min。

11.洗去一抗:用PBS冲洗掉组织上的一抗,将切片放入修复盒内,用PBS洗3次,每次5 min。

12.加二抗:将切片从修复盒中取出,甩去切片上PBS液,放入湿盒内,然后每张切片加100μl用5%BSA稀释的二抗(稀释比:1:200),将湿盒放入恒温水浴箱37℃孵育50min。

13.洗去二抗:将湿盒取出,用PBS冲洗切片上二抗,将切片放入修复盒内用PBS洗3次,每次5min。

14.显色:甩去切片上PBS液,每张切片加50-100μl新鲜配制DAB显色液,在普通光学显微镜100倍视野下控制显色,显色完成用PBS将显色液冲洗掉来终止显色。

15.复染:显色完成后,将切片放在玻片架上用蒸馏水或自来水冲洗,用Mayer苏木素复染5min,自来水冲洗返蓝5min,流水冲洗。

16.脱水透明封片:将玻片架依次放入95%酒精I 5min -95%酒精II 5min-无水乙醇Ⅰ5min -无水乙醇Ⅱ5min -二甲苯Ⅰ5min -二甲苯Ⅱ5min中脱水透明,将切片从二甲苯拿出来稍晾干,中性树胶封片。

17.拍照选取视野:将封固好的切片晾干后,置于倒置显微镜用200倍视野选取视野,每个组织片选取三个200倍视野来进行统计分析。