实验技术服务

TECHNICAL SERVICE

免疫共沉淀(Co-IP)实验步骤

1、蛋白提取

1)贴壁细胞总蛋白提取:

用PBS缓冲液润洗贴壁细胞2-3次,最后一次尽量吸干残留液。加入适当体积的IP裂解液(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)于培养板/瓶内裂解3-5min。期间反复晃动培养板/瓶,使试剂与细胞充分接触。用细胞刮刀将细胞及试剂刮下,收集到1.5mL离心管中。冰浴30min,期间用移液器反复吹打,确保细胞完全裂解。4℃12000rpm离心5min,收集上清,取上清1/10作为Input,剩余样本做IP。

2)悬浮细胞总蛋白提取:

低速离心收集细胞,加入适当体积的冷却的PBS缓冲液重悬,2000rpm离心10 min,吸除上清。重复以上操作两次,收集细胞沉淀。加入适当体积的IP裂解液(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂),振荡。冰浴30min,期间用移液器反复吹打,确保细胞完全裂解。4℃12000rpm离心5min,收集上清,取上清1/10作为Input,剩余样本做IP。

3)组织总蛋白提取:

组织块用预冷的PBS缓冲液漂洗2-3次,去除血污,剪成小块置于匀浆器中。加入10倍于组织体积的IP裂解液(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂),冰浴彻底匀浆。将匀浆液转移至离心管中,振荡。冰浴30min,期间用移液器反复吹打,确保匀浆液完全裂解。4℃12000rpm离心5min,收集上清,取上清1/10作为Input,剩余样本做IP。

2、蛋白浓度定量

使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度。

3、磁珠预处理

取20μl磁珠加入适当体积的IP裂解液于离心管中,置于垂直摇床上洗涤5min后,将离心管置于磁力架上静置5-10s,吸掉上清(尽量避免碰到磁珠)。

4、裂解液预处理

向细胞裂解液上清或者组织裂解上清中加入1.0μg IgG(与COIP实验用于沉淀的抗体种属来源相同的普通IgG)和20μl磁珠(使用前充分混匀),4℃摇转孵育30min。

5、IP过程

① 取以上相同量细胞裂解液或者组织裂解液上清1到1.5ml离心管中,加入1-10μL(0.2-2μg)抗体沉淀两种相互作用的蛋白质中的一种(同时加相同量的与用于沉淀的抗体种属来源相同的普通IgG作为阴性对照,阴性对照实验),然后4℃孵育1h;(一般加入1.0μg沉淀抗体,具体沉淀抗体加入量根据IP级抗体使用说明书进行稀释)。

② 再加入20μl磁珠(使用前充分混匀),用手指轻轻弹匀,4℃摇转孵育过夜;

③ 将离心管置于磁力架上静置5-10s,吸掉上清(尽量避免碰到磁珠)。

④ 加入适当体积的Washing buffer于离心管中,置于垂直摇床上洗涤3min后,将离心管置于磁力架上静置5-10s,吸掉上清(尽量避免碰到磁珠)。

⑤ 重复④操作3次。

⑥ 最后一次洗涤之后,小心弃去上清后,加入适当体积2×SDS含巯基乙醇的上样缓冲液,沸水煮10min,样本置于-20℃保存。

6、SDS-PAGE电泳

制胶与上样

①配制分离胶(见附录1),加入TEMED后立即摇匀灌胶。在胶面上缓慢加入适量水以压平胶面,约45min后倒去胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干。

②配制浓缩胶(见附录2),加入TEMED后立即摇匀灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。

③拔出梳子,将电泳架放入电泳槽中,加入电泳缓冲液,将样品加入点样孔中。

④按浓缩胶80V、分离胶120V进行恒压电泳,至溴酚蓝到达胶板下沿。

7、转膜

1)准备转膜滤纸和PVDF膜,PVDF膜在使用之前先用甲醇活化。

2)按照正负极的方向摆放转膜“三明治”结构,从正极到负极依次为转膜海绵、3层滤纸、PVDF膜、胶、3层滤纸、转膜海绵,摆放过程中要除尽各层中气泡。

3)按300mA恒流转膜,转膜时间根据目的蛋白分子量大小调整。

8、抗体孵育

1)将转好的膜加入封闭液室温封闭1h。

2)除去封闭液,加入已稀释好的一抗4℃过夜。

3)回收已稀释的一抗,用TBST洗三次,每次5min

4)加入稀释好的二抗,室温孵育30min,用TBST在室温下摇床上洗四次,每次5min。

9、化学发光检测

1)滴加新鲜配制的ECL混合溶液到膜的蛋白面侧,暗室中曝光。

2)根据不同的光强度调整曝光条件,显影、定影。

10、结果分析

将胶片进行扫描存档,AlphaEaseFC软件处理系统分析目标带的光密度值。