实验技术服务

TECHNICAL SERVICE

EMSA实验步骤

1. 蛋白提取

按照核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒说明书操作步骤提取核蛋白。

2. 蛋白浓度定量

使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度。

3. 制胶 (1mm胶,大约5分钟胶会凝)

试剂

浓度6.5%

H2O   ml

6.8

5*TBE   ml

1

40%丙烯酰胺(37.5:1)ml

1.65

50%甘油  ul

500

10%AP   ul

100

TEMED  ul

10

总体积ml

10

待胶完全凝固后100v预电泳1h,缓冲液用预冷的0.5×TBE。

4. 蛋白与探针反应

试剂名称

体积

10×binding buffer

2ul

1ug/ul poly(dl.dc)

1ul

50%glycerol

1ul

1%NP-40

1ul

100m M Mgcl2

1ul

核蛋白(unit)

阴性对照反应:0

阳性对照反应:1

冷探针竞争反应:1

常规反应:1

DNA(pmol/ul)

阴性对照反应:0ul

阳性对照反应:0ul

冷探针竞争反应:1ul

常规反应:0ul

BIO-DNA(fmol/ul)

阴性对照反应:1ul

阳性对照反应:1ul

冷探针竞争反应:1ul

常规反应:1ul

总体积

ddH2O补足至20ul

混合后室温放置20分钟或以上。

5. 上样

预电泳完后更换预冷的电泳缓冲液,加5ul的5×上样缓冲液到样品混合液中,马上上样电泳。150v 30-45分钟。

6. 电转移

将带正电的尼龙膜放入0.5×TBE中平衡10分钟。待电泳完成后将加有样品的整块胶取下电转。转膜缓冲液为预冷的0.5×TBE。380m A 30分钟。

7. 交联

转膜完成后将膜取出,放在一张干净的滤纸上,做好标记。于紫外交联仪下交联10min。

8. 封闭

用封闭液封闭15分钟。期间放于摇床上轻柔摇晃。

9. 抗体反应

倒掉封闭液。用封闭液将抗体稀释300倍后,与膜完全作用15分钟。期间放于摇床轻柔摇晃。

10. 洗脱

用1×的洗脱液清洗5分钟4次。

11. 平衡

用平衡液平衡5分钟。

12. ECL发光检测。

1)滴加新鲜配制的ECL混合溶液到膜的蛋白面侧,暗室中曝光。

2)根据不同的光强度调整曝光条件,显影、定影。

13. 结果分析

将胶片进行扫描存档,AlphaEaseFC软件处理系统分析目标带的光密度值。